猫杯状病毒（Feline Calicivirus, FCV）是猫科动物中广泛传播的一种病毒，其高变异性为疫苗开发带来了重大挑战。为了评估疫苗在面对异源田间毒株时的保护能力，建立科学严谨的实验模型尤为关键。本文从实验技术和操作的角度，讨论如何设计一个完善的FCV田间毒株挑战实验。
实验目的与总体设计
本实验旨在通过疫苗接种和异源病毒挑战感染，研究改良活疫苗（Modified-Live Vaccine, MLV）的免疫效果。实验以10只无特定病原体（SPF）的健康猫为研究对象，分为两组：接种组接种含有FCV F9株的三价疫苗，对照组接受等量安慰剂注射。随后，两组猫分别接受两次不同田间毒株的口鼻感染。
实验按照以下时间线设计：
- 第一次接种：在15周龄和18周龄分别进行两次疫苗接种或安慰剂注射，间隔21天。
- 第一次挑战：在最后一次接种后7个月，用异源毒株FCV 273进行口鼻感染。
- 第二次接种：第一次挑战后11个月，再次接种疫苗或安慰剂。
- 第二次挑战：第二次接种1个月后，用另一异源毒株FCV 27进行感染。
样本采集与实验操作
1. 血液样本采集与处理
每只猫在关键时间点从前肢静脉采集血液，无需麻醉。采集的血液样本按功能分为三部分：
- 普通试管：用于抗体检测。
- EDTA抗凝管：用于细胞因子mRNA检测。
- 肝素抗凝管：分离外周血单个核细胞（PBMC），用于细胞免疫评估。
样本处理后，PBMC储存于液氮中，其他血样冷冻保存。
2. 病毒挑战感染
田间毒株（FCV 273和FCV 27）在猫胚胎成纤维细胞中扩增。感染时，每只猫以均一剂量的病毒溶液进行口鼻滴注。此方法既能模拟自然感染，又便于病毒量的精准控制。
3. 检测指标与方法
实验采用多种检测手段全面评估疫苗的免疫保护效果：
- 体液免疫：采用免疫荧光法（IFA）检测血清抗体滴度，同时通过病毒中和实验确认抗体的功能性。
- 细胞免疫：使用流式细胞术分析T细胞（CD4+、CD8+）和B细胞（CD45R/B220+）的比例和数量；通过ELISpot检测PBMC的γ干扰素（IFN-γ）释放水平；使用qPCR定量检测细胞因子（如IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B等）的mRNA表达。
- 病毒感染反应：记录病毒脱落量、血液病毒RNA水平，以及相关的临床表现（如口腔溃疡、呼吸症状等）。
参考文献：
Modified-Live Feline Calicivirus Vaccination Elicits Cellular Immunity against a Current Feline Calicivirus Field Strain in an Experimental Feline Challenge Study
